自噬(autophagy)是細(xì)胞受到---后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過程，自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和異常蛋白---物，損傷或多余細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、
---和---等。單丹---尸胺(dansylcadaverine，mdc是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被于檢測(cè)自噬體形成的特---標(biāo)記染色劑，其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm ，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm。leagene mdc染色液適用于培養(yǎng)細(xì)胞的自噬染色，單細(xì)胞測(cè)序，可與eb合用雙染。
軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗(yàn)基本步驟:
(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶---并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活l細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血l清的dmem培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1x106細(xì)胞/l。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置co2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%co2溫箱中培養(yǎng)10~14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞數(shù)。計(jì)算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫l瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗(yàn)。
軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克l隆)
將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個(gè)孔1.4ml溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶---后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，新疆細(xì)胞，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml，將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，室溫凝固。置于37目，5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上得克l隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，spotll 采集圖像。
細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法
霉菌污染
正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見絲狀和團(tuán)塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時(shí)，雖然細(xì)胞仍在生長(zhǎng)，但它們的生命狀態(tài)會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間后逐漸惡化。
解決方法：用---銅溶液擦拭 co2 培養(yǎng)箱，向托盤中加入飽和---銅或消毒后加入飽和磷---二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。
如果霉菌污染，暫時(shí)轉(zhuǎn)移所有細(xì)胞，并立即使用 guo 氧擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧放在培養(yǎng)箱中一小時(shí)，使蒸汽擴(kuò)散，待 guo 氧氣味消散后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每?jī)蓚�(gè)月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。
為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang
線菌素 d 或青鏈。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述，也沒有什么區(qū)別。對(duì)于支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)，選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無支原體的儲(chǔ)存液，消毒環(huán)境。如果所有的細(xì)胞都被污染了，那可能是整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對(duì)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行檢查。如果只是個(gè)別污染，可能是操作問題，有---注意實(shí)驗(yàn)操作步驟的規(guī)范。
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