細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢---建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系
慢---包裝：公司使用3質(zhì)粒慢---包裝系統(tǒng)，慢---系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過表達(dá)慢---系統(tǒng)使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)�；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化。純化后留取部分檢測(cè)---滴度，其余---凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測(cè)：將---顆粒使用梯度稀釋，分別293t細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算---滴度。
細(xì)胞：在---前---對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋---，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，293t細(xì)胞，---數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的moi加入若無moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，6h后去除含---溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，河南細(xì)胞，使用定量pcr和western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)流程：慢---質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞----收集----純化----滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定
結(jié)果示例：
圖 a ---滴度檢測(cè)；b 目的細(xì)胞---效果圖
磁性細(xì)胞標(biāo)記方式
應(yīng)用macs技術(shù)進(jìn)行磁性細(xì)胞分選重要的一點(diǎn)是高的標(biāo)記。要盡可能地增強(qiáng)陽性細(xì)胞的標(biāo)記，并減弱背景染色。有兩種基本的磁性標(biāo)記方式:直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。
1、直接磁性細(xì)胞標(biāo)記(direct ---ic cell labeling)
(磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞)直接標(biāo)記是快速、zui特異的磁性標(biāo)記方法。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類靈長(zhǎng)類細(xì)胞的macs直標(biāo)微珠可供選用。
2、間接磁性細(xì)胞標(biāo)記(indirect ---ic cell labeling )
(磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場(chǎng)的細(xì)胞為所需細(xì)胞)間接磁性細(xì)胞標(biāo)記需要聯(lián)合使用單ke隆或者多ke隆抗ti和macs間標(biāo)微珠。未結(jié)合抗ti、生物素化抗ti或者熒光素標(biāo)記抗ti均可作為一抗標(biāo)記細(xì)胞，再使用抗免yi球蛋白微珠、抗生物素或鏈霉親和素微珠、抗熒光素微珠作為二抗磁性標(biāo)記細(xì)胞。幾乎針對(duì)任何種系任何細(xì)胞的任何一種單抗或多抗，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，均可用于間接標(biāo)記。間接標(biāo)記主要在如下情況時(shí)選用:當(dāng)沒有直標(biāo)磁珠時(shí);需要用幾種抗ti的混合物同時(shí)分選或去除多種類型的細(xì)胞;間接標(biāo)記有放大作用，因此可在磁性分選抗原表達(dá)弱的目的細(xì)胞時(shí)使用;使用自備或者配體的磁珠分選中。( -般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。)
大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
方法：分離大鼠主動(dòng)脈，直接貼壁于培養(yǎng)皿中，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免yi組化ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長(zhǎng)出，7天即融合成片.---傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形，單層生長(zhǎng)，鋪路石狀，ⅷ因子表達(dá)陽性，呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，凍存細(xì)胞存活率高，為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.
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