細(xì)胞elispot檢測
1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用pbs洗滌3次，每次3min；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，pbs-t洗滌3次，每次3min；
3．制備細(xì)胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，---實(shí)驗(yàn)，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度104-106/ml的細(xì)胞懸液，置37℃，5％co2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，pbs-t洗滌3次，細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)報(bào)告，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
6．加入辣根---化物酶結(jié)合的親合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，棄掉液體，pbs-t洗滌3次，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mltmb溶液4mg/ml jia醇溶液滴加入7.5ml10%明膠溶液用ph5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。
mtt檢測
mtt 是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活xi胞線粒體中的---脫氫酶能使外源性 mtt 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚formazan并沉積在細(xì)胞中，而---無此功能。二jia基---dmso能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。
大鼠shen小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)
2.原代細(xì)胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:sd大鼠用25%烏拉坦腹整注-zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動(dòng)脈，以無菌的冷hank液漱朱洗血.同時(shí)剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白，湖北細(xì)胞，取出雙shen冰浴保存。
(2)shen小球分離:參照green等方法改進(jìn)。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過80.120和200目鋼篩。收集shen小球。
(3)shen小球---和培養(yǎng)；將提取的shen小球加人0.1% in 型膠原酶---后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶內(nèi)，加a配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(mfm.hepes 20 mmnovl 20%胎牛xue清0. 66 u---/ml.血管內(nèi)皮生長因子20 ng /ml、---鈉100 u/ml.青莓su100 u/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進(jìn)行純化。
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